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Proteinase K, 25 mg

Proteinase K gehört zur Familie der Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen. Sie besitzt endo- und exoproteolytische Aktivität. Aktiviert durch Calcium (1-5 mM) verdaut das Enzym Proteine bevorzugt...

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Proteinase K gehört zur Familie der Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen. Sie besitzt endo- und exoproteolytische Aktivität. Aktiviert durch Calcium (1-5 mM) verdaut das Enzym Proteine bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren (aliphatische, aromatische und andere hydrophobe Aminosäuren). Proteine werden komplett verdaut, wenn die Inkubationszeit lang genug ist und die Protease-Konzentration hoch ist. Werden die Calciumionen entfernt sinkt die Stabilität des Enzyms, auch wenn die proteolytische Aktivität erhalten bleibt. Proteinase K hat zwei Ca²+-Bindungsstellen, die in der Nähe zum aktiven Zentrum lokalisiert sind, aber nicht direkt in den katalytischen Mechanismus involviert sind. Beseitigung der Ca²+-Ionen reduziert die katalytische Aktivität der Proteinase K um 80 %. Die verbleibende Aktivität reicht aus um Proteine abzubauen, die üblicherweise Nukleinsäurepräparationen verunreinigen. Deshalb wird der Verdau mit Proteinase K für die Nukleinsäurereinigung gewöhnlich in Gegenwart von EDTA durchgeführt (Hemmung Magnesium-abhängiger Enzyme). Ist die Anwesenheit von Ca²+ notwendig, wird Ca²+ bis zu 1 mM zugegeben und später mit EGTA beseitigt (pH 8,0; Endkonz. 2 mM). Das pH-Optimum liegt bei 8, das Enzym ist aber in einem weiten pH-Bereich aktiv (pH 4,3-12). Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 37°C auf 50 - 60°C kann die Aktivität mehrfach erhöhen, ebenfalls eine Zugabe von 0,5-1 % SDS. Temperaturen über 65°C, Trichloressigsäure oder die Serinprotease-Inhibitoren AEBSF, PMSF oder DFP hemmen die Aktivität. Proteinase K wird nicht durch EDTA, Harnstoff (1-4 M), SDS, Citrat, Iodessigsäure oder, interessanter Weise, durch andere Serinprotease-Inhibitoren wie TLCK und TPCK gehemmt. Muss Proteinase K inaktiviert werden, ist darauf zu achten, dass die Temperatur nicht unter 95°C liegt und die Dauer nicht 10 Minuten unterschreitet. Auch eine TCA-Fällung ist geeignet.
Proteinase K wird für den Abbau von Proteinen in Zelllysaten (Gewebe, Zellkulturzellen) und zur Freisetzung von Nukleinsäuren verwendet, da sie auch sehr effektiv DNasen und RNasen inaktiviert. Hier einige Anwendungsbeispiele: Herstellung genomischer DNA aus Bakterien (Miniprep): Bakterien aus einer gesättigten Flüssigkultur werden lysiert und Proteine durch Verdau mit 100 µg/ml Proteinase K für 1 h bei 37°C entfernt; Whole-Mount in situ hybridization und Nachweis von RNAs in Vertebratenembryos und isolierten Organen: Verdau der Probe z. B. in 10 µg/ml Proteinase K für 15 Minuten bei Raumtemperatur; Die Dauer der Behandlung und/oder die Konzentration des Enzyms muss optimiert werden; Herstellung von DNA aus Zellen oder Gewebe für die PCR: Zellen oder Gewebe werden über Nacht bei 50°C mit 100 µg/ml Proteinase K inkubiert; Isolierung von Vaccinia-Virus DNA: Verdau des Virus in einer Suspension mit 2 mg/ml Proteinase K für 4 h bei 37°C; Vor der Phenolextraktion zur Reinigung von Nukleinsäuren kann ein Proteinase K-Verdau eingeführt werden (50 - 200 µg/ml Endkonzentration; 37°C für 30 Minuten in Gegenwart von SDS). Die empfohlene Arbeitskonzentration liegt bei 10 - 100 µg/ml.
Stabilität: Proteinase K ist bei +4°C im lyophilisierten Zustand mindestens 12 Monate stabil. In Lösung beträgt die Stabilität bei +4°C bis -20°C ca. 6 - 12 Monate. Als Lösungsmittel für Stammlösungen (10-20 mg/ml) sind zum Beispiel 10 mM CaCl2 oder 50 mM Tris · HCl, pH 8,0; 1 mM CaCl2 oder 50 % Glycerin; 20 mM Tris · HCl, pH 7,4; 1 mM CaCl2 oder 50 % Glycerin; 50 mM Tris · HCl, pH 8,0; 1 mM CaCl2 geeignet.
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