Beim Durchgang durch die Farbstofflösung nimmt die Licht Intensität ab (s. Abbildung). Ist Io die Intensität des eintretenden Lichtstrahles und I die Intensität des austretenden Lichtstrahles, so wird das Verhältnis 1/Io als Transmission (T) bezeichnet.
Wird die Transmission in % angegeben, so gilt:
T (%) = I / Io x 100
Im deutschen Schrifttum findet man auch den Begriff der Absorbtion, definiert als A = 1 - Transmission
Wird in einem Experiment die Intensität des Lichtes beim Durchgang durch eine Küvette mit Farbstofflösung auf die Hälfte geschwächt (T = 50%) und bringt man eine zweite gleiche Küvette mit gleicher Farbstofflösung zusätzlich in den Strahlengang, so wird die Intensität erneut halbiert. Die Transmission nach Durchgang durch die zweite Küvette beträgt nur noch 25 %, nach Durchgang durch eine dritte, gleichartige, nur noch 12,5 %. Bringt man in dem gedachten Experiment nicht eine zweite und dritte Küvette mit Farbstofflösung hintereinander in den Strahlengang des Photometers, sondern verdoppelt oder verdreifacht die Farbstoffkonzentration in der ersten Küvette, so hat dieses den gleichen Effekt. Auch hier betragt dann die Transmission nur noch 25 bzw. 12,5 %. Die Transmission nimmt also exponentiell ab mit der Schichtdicke der Farbstofflösung einerseits und mit der Konzentration c der Farbstofflösung andererseits.
Durch die Einführung eines Proportionalitätsfaktors f. (Extinktionskoeffizient) gilt für die Beziehung zwischen Transmission, Konzentration des Farbstoffs und Schichtdicke:
Da eine exponentielle Abhängigkeit für Berechnungen unpraktisch ist, verwendet man für Konzentrationsmessungen eine von der Konzentration linear abhängige Messgrobe, die Extinktion E (engl.: absorbance A), die durch Logarithmieren aus der Transmission hervorgeht:
Schema: Zusammenhang zwischen Transmission und Extinktion
Der Extinktionskoeffizient ist die Extinktion einer Losung der Konzentration c — 1 mol/l bei der Schichtdicke d = 1 cm. 
ist eine für eine spezielle Substanz typische Größe und abhängig von der Wellenlänge. Ist bekannt. So lässt sich die Konzentration einer Substanz direkt aus der Extinktion berechnen. Dabei ist eine unspezifische Lichtabsorption, z.B. durch das Glas der Küvette und durch andere in der Lösung befindlichen Substanzen, zu berücksichtigen. Praktisch erfolgt die eigentliche Messung im Photometer gegen einen entsprechenden Leerwert.
Theoretische Grundlagen — Physikalisches Praktikum
Versuch 12: Fotometrie und Polarimetrie
Licht als elektromagnetische Welle
- sichtbares Licht ist eine elektromagnetische Welle
- andere elektromagnetische Wellen sind Röntgenstrahlen, y-Strahlen, ultraviolettes Licht, infrarotes Licht, Radiowellen
- sichtbares Licht breitet sich im Vakuum mit der Geschwindigkeit aus
- Ausbreitungsgeschwindigkeit c, Wellenlänge λ und Frequenz f stehen in folgendem Zusammenhang
- Spektralbereich von sichtbarem Licht: etwa 400 nm (violettes Licht) bis 750 nm (rotes Licht)
nach kürzeren Wellenlängen schließt sich ultraviolettes Licht an
nach höheren Wellenlangen folgt infrarotes Licht
Aufbau eines Fotometers
- Gerat zur Analyse von Proben, die die Intensität von Licht schwachen
- Monochromator: zerlegt Licht in einzelne spektrale Anteile und lasst nur Licht einer bestimmten Wellenlange λ (monochromatisches Licht) hindurch. Als Monochromatoren werden Prismen, Beugungsgitter oder Interferenzfilter verwendet
- Transmission T (auch Durchlässigkeit genannt)
- Extinktion E
- Der Zusammenhang zwischen Transmissin und Extinktion bzw. die möglichen Werte dieser Größen werden in der folgenden Tabelle dargestellt.
Lambert-Beer’sche Gesetz
- für verdünnte Losungen gilt die Proportionalität zwischen Extinktion und Konzentration der absorbierenden Substanz in Lösung
d - Lange des optischen Weges in der Küvette, Schichtdicke der Küvette
c - Konzentration des gelösten Stoffes in mol/1 (I mol/1 = I M) oder g/cm³ ei - Extinktionskoeffizient; der Index λ drückt aus, dass diese Größe von der Wellenlange des verwendeten Lichtes abhängt
ελ wird in der Einheit 
angegeben, je nachdem welche Einheit für die Konzentration gewählt wurde
Konzentrationsbestimmung
- mit dem Lambert-Beer’schen Gesetz kann die unbekannte Konzentration einer Lösung bestimmt werden; dafür gibt es zwei Möglichkeiten
- mit Hilfe einer Eichkurve (bei unbekanntem ελ)
Ausgleichsrechnung zur Ermittlung des Extinktionskoeffizienten ελ. Die Extinktion wurde in Abhängigkeit von der Konzentration gemessen.
Die erhaltenen Messpunkte streuen ganz offensichtlich um die Gerade E = a + bc, die über eine Ausgleichsrechnung (lineare Regression) gefunden wurde. Deren Steigung b entspricht dem Produkt von ελ und d.
- direkt über das Lambert-Beer’sche Gesetz bei bekanntem ελ
- in biochemischen und medizinischen Laboratorien werden sehr häufig fotometrische Konzentrationsbestimmungen von Metaboliten durchgeführt
Spektrale Analysen
- Absorptionsspektrum: Abhängigkeit der Extinktion einer Lösung von der Wellenlänge des Lichtes; E = f(λ)
- mit einem Fotometer kann man ein Spektrum jedoch nur punktweise und damit sehr zeitaufwendig aufnehmen; für diesen Zweck sind sogenannte Spektralfotometer, bei denen der Wellenlängenvorschub automatisch realisiert wird, wesentlich besser geeignet
