Wandertag für DNA + Protein

Die Elektrophorese gehört zu den Standard-Arbeitstechniken biochemischen, biologischen oder medizinischen Laboratorien. Es bezeichnet „die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen oder gelöster Moleküle durch ein elektrisches Feld“ (aus Compendium of Chemical Terminology).  Folgende Makromoleküle oder Polymere können in einem „Festmedium“ aus Agarose oder Polyacryamid aufgetrennt werden: DNA, RNA, Protein bzw. Peptide oder Protein plus DNA. Diese Auftrennung erfolgt nach einem physikalischen Prinzip und der Verteilung von Ladungen an den entsprechenden Molekülen. Das Phosphat-Desoxyribonuklease- bzw. Phosphat-Ribonuklease-Rückgrat von Nukleinsäure ist negativ geladen. Die Auftrennung im Agaorsegel erfolgt in Richtung des positiven Pols oder Anode.

Proteine bzw. Peptide können unbehandelt („natives PAGE“) oder vorbehandelt in einem elektrischen Feld aufgetrennt werden. Wenn Proteine in ihre „kleineren“ Monomeren aufgetrennt und analysiert werden sollen, setzt man in der Regel die Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) oder Mercaptoethanol ein. Ohne die Zugabe des anionischen Tensides Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyclsulftate, SDS) werden diese Peptidketten nach der Ladung ihrer polaren Seitenketten im Polyacrylamidgel aufgetrennt. Um eine Aufteilung nach ihrer tatsächlichen Molekülgröße zu gewährleisten, werden die Peptide mit SDS umlagert („maskiert“). Sie erhalten somit eine negative Ladung, die proportional ihrer Größe entspricht. Daher spricht man auch von einer SDS-PAGE (SDS polyacryamid gel electrophoresis). Die 2-D-Gelektrophorese ist eine Variante mit einer zusätzlichen Auftrennung über den isolektrischen Punkt (isoelectric focus, IEF), das auf der Ladung der Seitenketten von Aminosäuren und der Wanderung in einem pH-Gradienten bis zur „elektrischen Neutralität“ beruht.

Eine Technik, die beide Methoden miteinander vom Prinzip verknüpft, ist der Electromobility Shift Assay (EMSA). Diese Technik dient zum Nachweis von Transkriptionsfaktoren, die eine Proteinstruktur haben und bei Aktivierung eines Gens an die DNA binden. Durch Markierung der DNA mit einem Radionukleoid (z.B Phosphor-32), Digoxygenin (DIG), Biotin oder Fluoreszent kann man den Protein-DNA-Komplex in der Regel in einem Polyacrylamidgel nachweisen. Agarosegele werden seltener verwendet. Bei der klassischen Technik mit radioaktivem Phosphor-32 wird das Gel noch in einem Vakuumtrockner mit Filterpapier und Folie eingeschweißt, bevor man die Radioaktivität mit einem Röntgenfilm detektieren kann.

Eine weitere, jedoch ausgediente Methode, ist der RNAse Protection Assay (RPA). Dieser diente zum Nachweis von mRNA nach Behandlung mit Nukleasen und Auftrennung in einem Polyacrylamidgel. Die „Sonden-mRNA“ wurde mit radioaktivem Phosphor-32 markiert. Die Banden wurden auf einem Röntgenfilm detektiert. Die Intensität der Banden war äquivalent zur nachgewiesenen mRNA in der Probe. Diese aufwendige Methode wurde durch die moderne quantitative Real-Time PCR ersetzt.

 

Materialien für ein Agarosegel und Laufpuffer:

Agarose, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS-Base), Borsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethidiumbromid, 1%ige lösung, 30 ml (giftig!), Midori Green Advanced oder Midori Green XTra (beide nicht gesundheitsgefährdend), SYBR-Green

Materialien für die Gelektrophorese:

Horizontales Elektrophoresesystem z.B. Horizontales Gelelektrophoresesystem (Midi), mit 2 Geltrays , Elektrophorese-Netzteil z.B. myVolt™ Touch Power Supply, DNA Standard („DNA ladder“) z.B. FastGene 50 bp DNA Marker (50 µg / 500 µl)

Dokumentation:

Geldokumentation mit einem UV-Tisch (klassisch) oder Blau-Grün-Technologie (LED-Technik, nicht gesundheitsgefährdend)

Wir empfehlen folgende Produkte: FastGene® Blue/Green GelPic LED Box, FAS Digi Pro Imaging System, FastGene FASV Imaging System

 

Materialien für ein Polyacrylamidgel und Laufpuffer:

Acrylamid, Ammoniumpersulfat (APS), TEMED, 25 ml, Tris(hydroxymethyl)- aminomethan-hydrochlorid (TRIS-HCl), Natriumdodecylsulfat (SDS), Glycin

Probenvorbereitung Proteine:

Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid (TRIS-HCl), Natriumdodecylsulfat (SDS), DTT für die Molekularbiologie, 5 g oder β-Mercaptoethanol für die Molekularbiologie, 100 ml, BROMPHENOLBLAU FARBSTOFF UND INDIKATOR 10GR, Glycerin

Materialien für die Gelelektrophorese:

Vertikales Elektrophoressystem z.B. Vertikales Elektrophoresesystem mit Blotting-Funktion, Elektrophorese-Netzteil z.B. myVolt™ Touch Power Supply, Proteinstandard z.B. BlueStar Prestained Protein Marker (500 µl), BlueStar Prestained Protein Marker (500 µl), BlueEasy Prestained Protein Marker (500 µl),

Färben von Proteinen nach Elektrophorese:

Coomassie® Brillantblau R-250 (C.I. 42660), 25 g, Coomassie V-250 oder Silberfärbungslösung, FastGene® Q-Stain 1 Liter

Sonderartikel für den Transfer der DNA/RNA oder Proteine auf eine Membran oder Zellstoff:

Vakuumtisch oder „vacuum blotter“

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